表 1.蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)方法摘要

4.1.1 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光

增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光 （ECL） 利用辣根過(guò)氧化物酶 （HRP） 或堿性磷酸酶 （AP） 偶聯(lián)的二抗來(lái)催化產(chǎn)生光的反應(yīng)。這是通過(guò)過(guò)冷CCD傳感器或X射線(xiàn)膠片檢測(cè)的，可以可視化印跡。

HRP偶聯(lián)次級(jí)因其即時(shí)信號(hào)生成和比AP偶聯(lián)次級(jí)更高的靈敏度而被*廣泛使用。使用AP偶聯(lián)副反應(yīng)時(shí)的另一個(gè)考慮因素是它們與磷酸鹽緩沖液不兼容。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應(yīng)與含有NaN的溶液一起使用3.

由于僅發(fā)射單一波長(zhǎng)的光，因此不可能進(jìn)行多重檢測(cè)，除非蛋白質(zhì)靶標(biāo)以不同的分子量存在，從而可以在同一膜上同時(shí)探測(cè)多個(gè)靶標(biāo)（例如見(jiàn)圖2）。如果多個(gè)靶標(biāo)的分子量相似，則需要?jiǎng)冸x并重新探測(cè)印跡。

圖2.使用抗體檢測(cè)不同分子量靶標(biāo)的ECL示例。使用小鼠單克隆抗NFL抗體（HB6433）和小鼠單克隆抗GAPDH（HB9177）探測(cè)從各種組織裂解物轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的膜。使用與HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠多克隆抗體完成可視化。由于NFL和GAPDH的分子量不同，這使得多路復(fù)用變得容易。NFL和GAPDH的不同信號(hào)強(qiáng)度需要不同的曝光時(shí)間，這意味著每個(gè)目標(biāo)都需要單獨(dú)的面板。

4.1.2 顯色檢測(cè)

顯色檢測(cè)利用HRP和AP偶聯(lián)抗體催化反應(yīng)，導(dǎo)致沉淀到膜上的有色最終產(chǎn)物。HRP的常見(jiàn)底物有：

• 3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：產(chǎn)生具有高信噪比的藍(lán)色產(chǎn)品

• 氯-1-萘醇（4CN）：產(chǎn)生紫藍(lán)色產(chǎn)品。但是穩(wěn)定性和靈敏度的問(wèn)題

• 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）：產(chǎn)生棕色產(chǎn)品，可使用金屬離子增強(qiáng)。但是穩(wěn)定性有問(wèn)題。

AP 的常見(jiàn)基板有：

• 硝基藍(lán)四唑（NBT）/5-溴-4-氯吲哚磷酸酯（BCIP）：產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫色產(chǎn)品，耐褪色。

AP反應(yīng)可以通過(guò)與酸性溶液孵育來(lái)停止，因此允許與不同顏色的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行多重反應(yīng)。然而，AP共軛次級(jí)器件通常不如HRP檢測(cè)系統(tǒng)敏感，因此使用頻率要低得多。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應(yīng)與含有NaN的溶液一起使用3.

4.1.3 熒光檢測(cè)

熒光檢測(cè)利用熒光團(tuán)偶聯(lián)的二抗來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。由于PVDF在較低波長(zhǎng)下自發(fā)熒光，用于WB檢測(cè)的熒光團(tuán)往往具有高度紅移。ICC/IHC和WB中常用的熒光團(tuán)列表詳見(jiàn)表1。請(qǐng)參閱成像系統(tǒng)規(guī)格，查找熒光團(tuán)與激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)兼容的組合。

與ECL相比，熒光檢測(cè)的靈敏度較低，但通過(guò)使用具有足夠不同的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)的熒光團(tuán)可以輕松進(jìn)行多重檢測(cè)。隨著時(shí)間的推移，熒光信號(hào)也比ECL信號(hào)更穩(wěn)定，允許輕松重新成像，同時(shí)比ECL檢測(cè)變化更小，因?yàn)樗灰蕾?lài)于可能受多種因素影響的酶促反應(yīng)。

4.2 免疫組織化學(xué)/免疫細(xì)胞化學(xué)

免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)利用熒光或顯色介導(dǎo)的檢測(cè)。方法之間的選擇將取決于樣品制備、實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)和設(shè)備可用性（概述見(jiàn)表2和圖3）。