人髓鞘堿性蛋白抗體（MBP-Ab）ELISA試劑盒說明書

人髓鞘堿性蛋白抗體（MBP-Ab）ELISA試劑盒僅供研究使用

預(yù)期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中MBP 抗體含量。

說明:

1.中、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。

2.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

3.濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。   

4.試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

實(shí)驗(yàn)原理:用純化的MBP蛋白抗原包被微孔板，制成固相載體，向微孔中分別加入待測樣品，然后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人的抗體進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的MBP Ab呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品中抗體的效價(jià)（抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數(shù)記為效價(jià)）。 

人髓鞘堿性蛋白抗體（MBP-Ab）ELISA試劑盒組成及試劑配制: 

1.酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）。 

2.樣品稀釋液（Sample Diluent）：2×20ml/瓶。

3.辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（HRP-anti-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）

4.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 

5.濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 

6.終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

需要而未提供的試劑和器材:

1.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.高速離心機(jī)

3.電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.干凈的試管和Eppendof管

5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6.蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存:

1.血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于37° C放置1小時(shí)或4° C過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注:標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

標(biāo)本的稀釋原則：首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗的稀釋原則：臨用前用樣品稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗加990μl樣品稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

操作步驟:

實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔加待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)60分鐘。

2.棄去液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液 100μl（按1μlHRP標(biāo)記抗體加99μl樣品稀釋液的比例配制，輕輕混勻）。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。

4.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見陽性孔內(nèi)有明顯藍(lán)色，即可終止）。

5.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

6.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

注：

1.用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2.每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。 

3.為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液。

5.建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法:

自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

計(jì)算:為檢測樣品中MBP蛋白抗體效價(jià)，客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計(jì)算抗體效價(jià)，一般采取以1:40為起始稀釋倍數(shù)（使用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋）。zui大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗(yàn)要求而定，zui終顯色與陰性對(duì)照孔進(jìn)行比較，有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效價(jià)。

注意事項(xiàng):

1.當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3.一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.底物請(qǐng)避光保存。

6.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

特異性:本試劑盒可同時(shí)檢測天然或重組的人MBP抗體，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期:6個(gè)月