人丙酮酸脫氫酶E1（PDH E1）ELISA試劑盒使用說明書

人丙酮酸脫氫酶E1（PDH E1）ELISA試劑盒僅供研究使用

預期應(yīng)用:ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)液體中丙酮酸脫氫酶-E1含量。

實驗原理:本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中丙酮酸脫氫酶-E1水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入丙酮酸脫氫酶-E1抗原、生物素化的抗人丙酮酸脫氫酶-E1抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的丙酮酸脫氫酶-E1呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 

組成及試劑配制: 

1.酶聯(lián)板：一塊（96孔） 

標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為100 nmol/L，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成100 nmol/L，50 nmol/L ，25 nmol/L，12.5 nmol/L，6.25 nmol/L，3.12 nmol/L，1.56 nmol/L，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 nmol/L，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制50 nmol/L標準品：取0.5ml 100 nmol/L的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

2.樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

3.檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

4.檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

5.檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

6.檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

7.底物溶液：1×10ml/瓶。 

8.濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 

9.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 

標本的采集及保存:

1.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。 

2.血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟:

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。 

4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 

2.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。

3.未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

4.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。

洗板方法:

1.自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

2.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。

計算:以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 

注意事項:

1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3.請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。

4.如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6.底物請避光保存。

特異性:本試劑盒可同時檢測重組或天然的人丙酮酸脫氫酶-E1，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

說明:

1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

2.小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。

3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標簽上的標示為準。

4.濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 

5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。 

6.中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

7.所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

8.有效期：6個月