大鼠表皮生長因子（EGF）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒

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大鼠表皮生長因子（EGF）酶聯(lián)免疫分析試劑盒僅供研究使用。

乾思生物編輯整理： 

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檢測范圍：7.8 pg/ml - 500 pg/ml

zui低檢測限：2.0 pg/ml,

性：大鼠表皮生長因子（EGF）酶聯(lián)免疫分析試劑盒可同時檢測天然或重組的大鼠EGF，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期：6 個月預(yù)期應(yīng)用：ELISA 法定量測定大鼠血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中EGF 含量。

大鼠表皮生長因子（EGF）酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明:

1 試劑盒保存：未開封的試劑盒應(yīng)儲存于2-8℃；開封后的酶標(biāo)板應(yīng)與干燥劑一起儲存于鋁箔袋中置于2-8℃保存。僅在此出儲存條件下，產(chǎn)品在有效期內(nèi)可正常使用。

2 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。

4 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

實(shí)驗(yàn)原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗EGF 抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗EGF 抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的EGF 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。12試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）： 一塊（96 孔）。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）： 2 瓶（凍干品）。

3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）： 1×20ml/瓶。

4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）： 1×10ml/瓶。

5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent） 1×10ml/瓶。

6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）： 1×120μl/瓶（1：100）。

7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）： 1×120μl/瓶（1：100）。

8. 底物溶液（TMB Substrate）： 1×10ml/瓶。

9. 濃洗滌液（Wash Buffer） 1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

10. 終止液（Stop Solution）： 1×10ml/瓶。

  需要而未提供的試劑和器材

1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2. 高速離心機(jī)

3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱

4. 干凈的試管和Eppendof 管

5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6. 蒸餾水。

  容量瓶等標(biāo)本的采集及保存

1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2 小時或4℃一夜后于1000g 離心20 分鐘，取上清即可立即檢測；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測。

2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8°C1000 g 離心15 分鐘，取上清即可立即檢測；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g 離心20 分鐘，取上清即可立即檢測；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

13標(biāo)本的稀釋原則：

  首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2 瓶，使用前于6000-10000rpm 離心30 秒。 每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為500 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋500 pg/ml,250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.2 pg/ml, 15.6 pg/ml, 7.8 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15 分鐘內(nèi)配制，用完丟棄，下次檢測使用新鮮配置的標(biāo)準(zhǔn)品。如配制250 pg/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）500 pg/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml 樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物素標(biāo)記抗體加990μl 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：打開瓶蓋前請離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。加樣時，槍頭應(yīng)直接對準(zhǔn)液面，切勿沿孔壁加樣。141 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60 分鐘。3 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，200μl/每孔，甩干。4 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液）100μl，37℃，60 分鐘。5 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，200μl/每孔，甩干。6 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30 分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。7 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。8 用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。 在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)備注1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及終止液。測量時先用此孔調(diào)OD 值至零。3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。15洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。計算請從我們的下載專業(yè)軟件"Curve Exert 1.3"，并根據(jù)提示制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)

1. 本操作說明適用于48T 試劑盒， 48T 試劑盒中酶聯(lián)板、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素減半。

2. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

3. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

4. 一次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

5. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

6. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

7. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

8. 底物請避光保存。

9. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

PS:大鼠表皮生長因子（EGF）酶聯(lián)免疫分析試劑盒,圖片，內(nèi)容僅供參考詳情請。

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