影響
大腸桿菌表達(dá)重組蛋白產(chǎn)量的因素是一個(gè)環(huán)環(huán)相扣的網(wǎng)絡(luò)，涵蓋了從基因序列的“源頭設(shè)計(jì)”到發(fā)酵培養(yǎng)的“過程控制”，再到宿主與目標(biāo)蛋白相互作用的“系統(tǒng)適配”。在實(shí)際工作中，必須采取系統(tǒng)生物學(xué)的思維，通過理性設(shè)計(jì)與高通量篩選相結(jié)合的策略，進(jìn)行多參數(shù)的協(xié)同優(yōu)化，才能突破瓶頸，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)重組蛋白的高效、高產(chǎn)表達(dá)。
一、基因水平的精準(zhǔn)設(shè)計(jì)
表達(dá)的成功始于基因的設(shè)計(jì)。密碼子偏好性是首要考量。大腸桿菌對某些同義密碼子具有明顯的使用偏好，若外源基因中含有過多稀有密碼子，尤其是連續(xù)存在時(shí)，會嚴(yán)重拖慢翻譯速率，導(dǎo)致核糖體停滯、翻譯錯(cuò)誤甚至提前終止。因此，在不改變氨基酸序列的前提下，將外源基因的密碼子優(yōu)化為大腸桿菌的偏好類型，是提高表達(dá)量的常規(guī)且有效的手段。
其次，表達(dá)載體的選擇與構(gòu)建至關(guān)重要。強(qiáng)效且可調(diào)控的啟動子，如T7、lac、trc等，能驅(qū)動基因的高水平轉(zhuǎn)錄；而一個(gè)有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）及其與起始密碼子之間的序列和間距，則直接決定了翻譯的起始效率。此外，載體拷貝數(shù)也需根據(jù)目標(biāo)蛋白的特性進(jìn)行權(quán)衡，高拷貝數(shù)通常意味著高轉(zhuǎn)錄水平，但有時(shí)也可能加重細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)或?qū)е沦|(zhì)粒不穩(wěn)定。
二、表達(dá)條件的精細(xì)調(diào)控
即使擁有了基因序列，表達(dá)過程的調(diào)控同樣決定成敗。誘導(dǎo)條件是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。對于常用的IPTG誘導(dǎo)系統(tǒng)，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)（通常在對數(shù)生長中期）、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)溫度都需要精細(xì)優(yōu)化。例如，對于易形成包涵體的蛋白，采用低溫（如25-30℃）和低濃度IPTG進(jìn)行緩慢誘導(dǎo)，有助于肽鏈正確折疊，增加可溶性蛋白的比例。
培養(yǎng)基本身也是不可忽視的因素。豐富的培養(yǎng)基（如TB、2xYT）能支持更高的菌體密度和蛋白產(chǎn)量。溶解氧的充足供應(yīng)對于好氧的大腸桿菌至關(guān)重要，在高密度發(fā)酵中尤其需要精確控制通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。同時(shí)，培養(yǎng)液的pH值應(yīng)維持在最適生長范圍內(nèi)（通常為6.8-7.4），以保障菌體的活力和代謝穩(wěn)定。
三、目標(biāo)蛋白自身的特性與宿主改造
目標(biāo)大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的自身屬性，如其氨基酸序列、分子大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性以及是否存在對宿主有毒的活性，都會深刻影響其最終產(chǎn)量。疏水性過強(qiáng)或含有多個(gè)二硫鍵的復(fù)雜蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)極易形成不溶性的包涵體，或發(fā)生錯(cuò)誤折疊。
針對這些問題，除了優(yōu)化表達(dá)條件，還可以對宿主菌株進(jìn)行改造或選擇。使用Origami、Rosetta-gami等能促進(jìn)二硫鍵正確形成的菌株，或表達(dá)分子伴侶（如GroEL/GroES、DnaK/DnaJ）共表達(dá)的菌株，可以有效提高復(fù)雜蛋白的可溶性和正確折疊率。對于毒性蛋白，則需選擇嚴(yán)密控制的表達(dá)系統(tǒng)，在生長階段抑制其表達(dá)，待菌體量達(dá)到要求后再進(jìn)行強(qiáng)力誘導(dǎo)。
四、下游加工的策略考量
表達(dá)策略的選擇直接影響下游加工的難度和最終收率。當(dāng)目標(biāo)蛋白以包涵體形式存在時(shí)，雖然易于通過離心初步純化且能避免被蛋白酶降解，但后續(xù)繁瑣的變性與復(fù)性過程常導(dǎo)致活性回收率低下。反之，可溶性表達(dá)雖然簡化了下游工藝，但可能需要更復(fù)雜的色譜步驟進(jìn)行純化，且在發(fā)酵液中可能更不穩(wěn)定。因此，需根據(jù)最終應(yīng)用目的（是否需要天然活性）來權(quán)衡和選擇表達(dá)策略。
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更新時(shí)間：2025-10-20
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