細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit）是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶染色（Propidium staining，即PI staining）方法進行細胞周期與細胞凋亡分析的檢測試劑盒。

    碘化丙啶（Propidium，簡稱PI）是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進行細胞周期和細胞凋亡分析。
    碘化丙啶染色后，假設(shè)G0/G1期細胞的熒光強度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度的理論值為2，正在進行DNA復制的S期細胞的熒光強度為1-2之間。凋亡細胞由于細胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA片段化（DNA fragmentation）導致部分基因組DNA片斷在染色過程中丟失，因此凋亡細胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染，即熒光強度小于1，在流式檢測的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰，即凋亡細胞峰。
    細胞發(fā)生凋亡時，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。在細胞凋亡的早期，細胞對前向角光散射的能力顯著降低，對側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化。在細胞凋亡的晚期，前向和側(cè)向光散射的信號均降低。因此可通過流式細胞儀測定細胞光散射的變化觀察細胞凋亡情況。
    本試劑盒通常應用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細胞的細胞周期與細胞凋亡檢測。如果用于組織的細胞周期與細胞凋亡檢測，則必須把組織消化成單細胞狀態(tài)，才可以進行檢測。
    本試劑盒足夠檢測50個樣品，每個樣品的細胞數(shù)量可以為10-100萬。

操作步驟

1.樣品處理

   1）玻片預先用多聚賴氨酸或APES進行處理。

   2）細胞涂片和冰凍切片：zui重要的是及時固定。用4%多聚甲醛/0.01MPBS（PH7.0---7.6）室溫下固定30—60分鐘。0.01MPBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌2分鐘×2次。

   3）組織：有條件時應及時固定。常規(guī)4%多聚甲醛/0.01MPBS（PH7.0---7.6）或10%中性緩沖福爾馬林固定4小時以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水（脫蠟務必干凈）。

2.新鮮配制3%H2O2，室溫處理10分鐘。蒸餾水洗滌2分鐘×3次。

3.標本片加0.01MTBS1:200新鮮稀釋ProteinaseK37℃消化1—15分鐘,0.01MTBS洗2分鐘×3次。（細胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化10—60秒鐘。新鮮石蠟切片消化5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化10-15分鐘）。

4.標本片加標記緩沖液（LabelingBuffer）20μι/片,以保持切片濕潤。按每張切片取TdT2和DIG-d-UTP各1μι，加入18μι標記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標記液，20μι/片。置樣品于濕盒中，37℃標記2小時。

5.0.01MTBS洗2分鐘×3次。

6.加封閉液50μι/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗。

7.用抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體：（取1ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗體10μι），混勻后50μι/片加至標本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應30分鐘。0.01MTBS洗2分鐘×3次。

8.用抗體稀釋液1：100稀釋SABC：取1ml抗體稀釋液加SABC10μι，混勻后50μι/片加至切片。37℃反應30分鐘。0.01MTBS洗5分鐘×4次。

9.DAB顯色：取1ml蒸餾水，分別加入DAB試劑盒中A，B，C試劑各一滴，混勻后加至標本片上，顯色10-30分鐘左右。水洗。

10.蘇木素輕度復染。0.01MTBS洗，蒸餾水洗。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。

保存條件：
    -20℃保存，一年有效。C1052-2碘化丙啶染色液（20X）需避光保存。本試劑盒可4℃保存，一個月內(nèi)有效。
注意事項：
    本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。
    需自備PBS和70%乙醇，PBS（C0221A）可以向碧云天訂購。
    熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
    碘化丙啶對人體有刺激性，請注意適當防護。
    為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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