PLC/PRF/5人肝癌細胞

PLC/PRF/5人肝癌細胞是源自人類原發(fā)性肝細胞癌的貼壁生長細胞系，因穩(wěn)定攜帶乙型肝炎病毒（HBV）基因組整合片段，且保留肝癌細胞典型惡性特征，成為研究 HBV 相關(guān)肝癌機制、病毒 - 宿主互作及肝癌藥物篩選的核心體外模型，為肝癌基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化提供關(guān)鍵實驗支撐。

一、核心生物學(xué)特性

（一）來源與病毒關(guān)聯(lián)特征

該細胞分離自肝癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織，經(jīng)體外傳代建系后，基因組中穩(wěn)定整合 HBV DNA 片段（含核心抗原與表面抗原基因），可持續(xù)表達 HBsAg、HBeAg 等 HBV 相關(guān)抗原，但不產(chǎn)生完整感染性病毒顆粒。這種特性既模擬臨床 HBV 感染相關(guān)肝癌的分子背景，又降低生物安全風(fēng)險，是研究 HBV 致肝癌機制的理想工具。

（二）形態(tài)與增殖特性

細胞呈多邊形或不規(guī)則梭形，貼壁生長時呈 “鋪路石" 樣排列，細胞間隙大于正常肝細胞，部分細胞胞質(zhì)含空泡（提示代謝異常）；細胞核大且多異形，核仁明顯，染色質(zhì)分布不均，偶見多核細胞，符合肝癌細胞惡性形態(tài)。增殖能力強，倍增時間 28-34 小時，對數(shù)生長期增殖速度遠超正常肝細胞，無接觸抑制，密度過高時可堆疊生長，傳代 50 代以上仍維持穩(wěn)定增殖與病毒相關(guān)表型。

（三）功能與分子特征

除肝癌通用惡性特征外，細胞具獨特功能：可分泌甲胎蛋白（AFP，陽性率高）、γ- 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）等肝癌標志物，同時持續(xù)表達 HBV 抗原，可通過 ELISA 或免疫熒光檢測；分子層面存在 p53 基因突變、PI3K/AKT 信號通路激活等肝癌常見異常，且 HBV 整合片段可影響 MYC 等宿主癌基因表達，高度貼合臨床 HBV 相關(guān)肝癌的分子病理特征。

二、體外培養(yǎng)關(guān)鍵條件

（一）培養(yǎng)基與環(huán)境

基礎(chǔ)培養(yǎng)基選用 DMEM（高糖），添加 10%-12% 低內(nèi)毒素胎牛血清（避免影響 HBV 抗原表達），同時加入 1% 無菌防護試劑防污染。培養(yǎng)基 pH 控制在 7.2-7.4，滲透壓 280-320mOsm/kg，可加 10mM HEPES 緩沖液穩(wěn)定 pH，避免環(huán)境波動影響細胞活性與抗原表達。培養(yǎng)環(huán)境需嚴格維持 37℃、5% CO?、95% 濕度，CO?濃度波動不超過 ±0.5%。

（二）傳代與維護

細胞貼壁生長且增殖快，傳代周期 2-3 天，匯合度達 80%-85% 時需傳代：37℃消化液孵育 1-2 分鐘，待細胞邊緣收縮脫離瓶壁，加含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打為單細胞懸液后按 1:4-1:6 比例接種。每日需觀察細胞狀態(tài)，若空泡增多、形態(tài)變圓或培養(yǎng)基渾濁，需及時換液或排查污染；若 HBV 抗原表達下降，需檢測血清質(zhì)量或調(diào)整溫度（嚴格 37℃）。

（三）凍存與復(fù)蘇

凍存時用含 10% 二甲基亞砜（DMSO）的胎牛血清作凍存液，梯度降溫（4℃ 30 分鐘→-20℃ 1 小時→-80℃過夜→液氮保存）；復(fù)蘇時 37℃水浴 1-2 分鐘解凍，加 5 倍體積培養(yǎng)基稀釋，離心去 DMSO 后接種，復(fù)蘇存活率超 75%，復(fù)蘇后需免疫熒光驗證 HBV 抗原表達，確保特性穩(wěn)定。

三、主要實驗應(yīng)用場景

（一）HBV 相關(guān)肝癌機制研究

可通過干擾 HBV 整合片段相關(guān)基因（如 HBx 基因），觀察細胞增殖、凋亡及癌基因表達變化，明確 HBV 蛋白對肝癌惡性表型的調(diào)控作用；也可通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選 HBV 整合誘導(dǎo)的差異基因（如 IFN 信號通路基因），解析 HBV 致肝癌分子通路，為早期干預(yù)提供靶點。

（二）肝癌藥物篩選

適用于 HBV 相關(guān)肝癌藥物研發(fā)：將不同濃度抗肝癌藥物（如 HBV 蛋白抑制劑、hua療藥）作用于細胞，MTT 法檢測活力并計算 IC50，評估殺傷效果；可構(gòu)建耐藥細胞株，研究 ABCB1 等耐藥基因表達，探究耐藥機制；還可檢測藥物對 HBV 抗原表達的影響，評估對病毒相關(guān)表型的調(diào)控作用。

（三）病毒 - 宿主互作研究

利用細胞攜帶 HBV 基因組的特性，通過 ChIP 技術(shù)分析 HBV 整合片段與宿主基因組結(jié)合位點，明確病毒整合對宿主基因的影響；檢測細胞對干擾素等抗病du藥物的反應(yīng)，研究宿主免疫通路對 HBV 相關(guān)肝癌細胞的調(diào)控，為 “抗病毒 + 抗肝癌" 聯(lián)合治療提供實驗基礎(chǔ)。

四、實驗注意事項

實驗前需 ELISA 或 Western blot 驗證 HBV 抗原（HBsAg、HBeAg）與 AFP 表達，確保特性穩(wěn)定，避免傳代超 50 代導(dǎo)致病毒表型退化；需預(yù)實驗篩選適配胎牛血清，固定批次使用。操作需無菌，每傳代 3 次 PCR 檢測支原體，污染后立即丟棄；雖無感染性病毒，但需在生物安全二級實驗室操作。結(jié)果解讀需結(jié)合臨床特征，與 HepG2 等非 HBV 相關(guān)肝癌細胞對比，避免片面性。