PIEC小鼠髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

PIEC小鼠髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是源自小鼠髖動(dòng)脈血管壁內(nèi)層的功能性?xún)?nèi)皮細(xì)胞，作為血管壁與血液間的關(guān)鍵屏障，兼具物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、血管穩(wěn)態(tài)調(diào)控及炎癥響應(yīng)等核心功能，且體外可穩(wěn)定培養(yǎng)并維持內(nèi)皮細(xì)胞特異性表型，成為研究血管生理、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的核心體外模型，為血管生物學(xué)基礎(chǔ)研究與心血管疾病臨床轉(zhuǎn)化提供關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)載體。

一、核心生物學(xué)特性

（一）來(lái)源與組織功能定位

PIEC 小鼠髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞從健康小鼠髖動(dòng)脈組織中分離獲取，經(jīng)膠原酶消化法解離血管壁后，通過(guò)差速貼壁法純化得到高純度細(xì)胞群體。在體內(nèi)，該細(xì)胞構(gòu)成髖動(dòng)脈血管的內(nèi)層屏障，直接接觸血液，主要承擔(dān)三大功能：一是物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)選擇性通透作用，介導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如葡萄糖、氨基酸）從血液進(jìn)入組織，同時(shí)排出代謝廢物；二是血管穩(wěn)態(tài)調(diào)控，分泌一氧化氮（NO）、前列環(huán)素等血管舒張因子，及內(nèi)皮素等收縮因子，維持血管張力平衡；三是抗血栓形成，通過(guò)表達(dá)血栓調(diào)節(jié)蛋白、前列環(huán)素等物質(zhì)，抑制血小板聚集與凝xue因子激活，防止血管內(nèi)血栓形成。

（二）形態(tài)與表型特征

細(xì)胞形態(tài)呈典型的 “鋪路石" 樣多邊形，貼壁生長(zhǎng)緊密排列，細(xì)胞間連接清晰（形成內(nèi)皮屏障結(jié)構(gòu)）；胞質(zhì)透明，含豐富的 Weibel-Palade 小體（儲(chǔ)存血管性血友病因子 vWF 的特異性結(jié)構(gòu)），及大量線(xiàn)粒體（支撐物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的能量需求）；細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，核仁不明顯，染色質(zhì)均勻分布。表型上，PIEC 小鼠髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin，介導(dǎo)細(xì)胞間連接）、CD31（血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，內(nèi)皮細(xì)胞鑒定核心標(biāo)志物）、vWF（血管內(nèi)皮特異性糖蛋白），同時(shí)表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體 2（VEGFR2，參與血管生成信號(hào)傳導(dǎo)），可通過(guò)免疫熒光或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)這些標(biāo)志物，純度達(dá) CD31?細(xì)胞占比≥95% 方可用于實(shí)驗(yàn)。

（三）功能特性

除基礎(chǔ)屏障功能外，PIEC 小鼠髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞還具備血管內(nèi)皮te有的活性功能：其一，血管生成能力，在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等誘導(dǎo)下，可發(fā)生增殖、遷移并形成管狀結(jié)構(gòu)（體外 Matrigel 膠成管實(shí)驗(yàn)可驗(yàn)證），模擬體內(nèi)血管新生過(guò)程；其二，炎癥響應(yīng)功能，當(dāng)受到脂多糖（LPS）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）等炎癥刺激時(shí)，會(huì)上調(diào)表達(dá)細(xì)胞間黏附分子 1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子 1（VCAM-1），介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，參與炎癥反應(yīng)；其三，凝血調(diào)節(jié)功能，正常狀態(tài)下通過(guò)表達(dá)血栓調(diào)節(jié)蛋白激活蛋白 C，抑制凝血；受損時(shí)則暴露膠原，激活凝xue因子 Ⅻ，啟動(dòng)凝血 cascade，這一功能使其成為研究血栓形成機(jī)制的理想模型。

二、體外培養(yǎng)關(guān)鍵條件

（一）培養(yǎng)基與添加因子

基礎(chǔ)培養(yǎng)基選用 DMEM/F12（1:1）混合培養(yǎng)基，需添加 10% 胎牛血清（篩選低內(nèi)毒素、無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞毒性的批次，避免影響細(xì)胞屏障功能），同時(shí)加入 1% glutamine（維持細(xì)胞代謝穩(wěn)定）及 1% 無(wú)菌防護(hù)試劑（預(yù)防細(xì)菌污染）。為維持內(nèi)皮細(xì)胞表型與功能，需額外添加關(guān)鍵因子：20ng/mL 表皮生長(zhǎng)因子（EGF，促進(jìn)細(xì)胞增殖）、10ng/mL 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF，維持內(nèi)皮特異性功能），及 5μg/mL 肝素（抑制平滑肌細(xì)胞污染，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁），若需研究血管屏障功能，可加入 1ng/mL 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β（TGF-β），增強(qiáng)細(xì)胞間連接緊密性。

（二）培養(yǎng)環(huán)境與操作

培養(yǎng)環(huán)境需嚴(yán)格控制為 37℃、5% CO?、95% 濕度的恒溫恒濕條件，CO?濃度波動(dòng)不超過(guò) ±0.5%，避免 pH 變化導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)異常（如 “鋪路石" 樣結(jié)構(gòu)消失）；因細(xì)胞貼壁依賴(lài)性強(qiáng)，需使用包被 0.1% 明膠的培養(yǎng)瓶（促進(jìn)細(xì)胞黏附，防止脫落），接種密度控制在 1×10? cells/cm2，避免密度過(guò)低導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。傳代時(shí)，待細(xì)胞匯合度達(dá) 80%-90%（避免過(guò)度匯合導(dǎo)致功能退化），用消化液（含 EDTA 的yi酶替代液）37℃孵育 1-2 分鐘，待細(xì)胞邊緣收縮呈圓形時(shí)，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，按 1:3 比例接種至新包被明膠的培養(yǎng)瓶，傳代周期約 3-4 天。

（三）凍存與復(fù)蘇

細(xì)胞凍存時(shí)，使用含 10% 二甲基亞砜（DMSO）、20% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基作為凍存液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為 5×10?-1×10? cells/mL 后分裝，采用梯度降溫法（4℃ 30 分鐘→-20℃ 1 小時(shí)→-80℃過(guò)夜→液氮保存），減少冰晶對(duì)細(xì)胞間連接的損傷；復(fù)蘇時(shí)，37℃水浴快速解凍（1 分鐘內(nèi)），立即加入 10 倍體積預(yù)熱培養(yǎng)基稀釋?zhuān)x心去除 DMSO（800×g 離心 5 分鐘），接種至明膠包被的培養(yǎng)瓶，復(fù)蘇存活率通?？蛇_(dá) 80% 以上，復(fù)蘇后需通過(guò)免疫熒光檢測(cè) CD31 表達(dá)，確保內(nèi)皮表型穩(wěn)定。

三、主要實(shí)驗(yàn)應(yīng)用場(chǎng)景

（一）血管生理與病理機(jī)制研究

PIEC 小鼠髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是該領(lǐng)域的核心模型：研究血管屏障功能時(shí)，可通過(guò)跨內(nèi)皮電阻（TEER）檢測(cè)細(xì)胞間連接緊密性，或通過(guò)熒光su鈉通透實(shí)驗(yàn)評(píng)估屏障通透性，模擬高血壓、糖尿病等疾病導(dǎo)致的內(nèi)皮屏障損傷；研究動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）處理細(xì)胞，觀察細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝?。ㄓ图t O 染色）及炎癥因子（如 IL-6、TNF-α）分泌變化，解析內(nèi)皮細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化早期的病理改變。

（二）血栓形成與抗血栓藥物篩選

利用細(xì)胞的凝血調(diào)節(jié)功能，可構(gòu)建血栓形成體外模型：用膠原或 ADP 刺激細(xì)胞，觀察血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附情況（免疫熒光檢測(cè)血小板標(biāo)志物 CD41），研究血栓形成起始環(huán)節(jié)；篩選抗血栓藥物時(shí)，將不同濃度藥物（如阿si匹林、低分子肝素）作用于細(xì)胞，檢測(cè)藥物對(duì) vWF 分泌、血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響，或通過(guò)凝血時(shí)間測(cè)定，評(píng)估藥物的抗凝血效果，為抗血栓藥物研發(fā)提供體外數(shù)據(jù)支持。

（三）血管生成相關(guān)研究與藥物測(cè)試

在血管生成研究中，將細(xì)胞接種于 Matrigel 膠上，加入 VEGF 或候選促血管生成藥物，通過(guò)顯微鏡觀察管狀結(jié)構(gòu)形成數(shù)量與長(zhǎng)度，評(píng)估藥物對(duì)血管生成的促進(jìn)作用；反之，加入抗血管生成藥物（如貝伐珠單抗），可觀察其對(duì)管狀結(jié)構(gòu)的抑制效果，為腫瘤抗血管生成治療、缺血性疾病血管修復(fù)治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，還可通過(guò) Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)，研究藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響，解析血管生成的遷移環(huán)節(jié)機(jī)制。

四、實(shí)驗(yàn)應(yīng)用注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)前需通過(guò)免疫熒光或 Western blot 驗(yàn)證內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物（CD31、VE-cadherin、vWF）的表達(dá)，確保細(xì)胞表型穩(wěn)定，避免傳代超過(guò) 15 代導(dǎo)致 “鋪路石" 樣形態(tài)消失、功能退化；不同批次胎牛血清對(duì)細(xì)胞血管生成能力影響較大，需通過(guò) Matrigel 成管實(shí)驗(yàn)篩選適配血清并固定使用。

培養(yǎng)過(guò)程中需嚴(yán)格維持無(wú)菌環(huán)境，PIEC 小鼠髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)支原體污染極為敏感，污染后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間連接破壞、TEER 值顯著下降，每傳代 3 次需通過(guò) PCR 檢測(cè)支原體，污染后需立即丟棄以防交叉感染；明膠包被培養(yǎng)瓶時(shí)需確保濃度均勻（0.1%），包被后 37℃孵育 1 小時(shí)，避免因包被不均導(dǎo)致細(xì)胞貼壁差異。

結(jié)果解讀需結(jié)合體內(nèi)血管微環(huán)境，體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏血管平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞等支持細(xì)胞的協(xié)同作用，且無(wú)法模擬體內(nèi)血流剪切力（髖動(dòng)脈正常血流動(dòng)力學(xué)環(huán)境），實(shí)驗(yàn)結(jié)論需結(jié)合動(dòng)物模型（如小鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎模型）或臨床樣本數(shù)據(jù)綜合分析；同時(shí)，需與其他部位內(nèi)皮細(xì)胞（如肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）對(duì)比，明確髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在血管張力調(diào)節(jié)、血栓抵抗等方面的組織特異性，避免結(jié)果片面。